自PCR技術(shù)誕生以來(lái)已經(jīng)有三十年了，從經(jīng)典PCR、實(shí)時(shí)定量PCR再到現在的數字PCR，這一技術(shù)在不斷蛻變卻從未淡出我們的視野。很多人的實(shí)驗根本離不開(kāi)PCR。筆者曾經(jīng)也接觸PCR很長(cháng)一段時(shí)間，加樣、設置程序、等待、檢測。這些過(guò)程看起來(lái)容易，但實(shí)驗結果卻總是會(huì )出人意料，很多時(shí)候根本不知道是哪里出了錯。那么要是有一款技術(shù)，它比PCR更快速、便捷、，你會(huì )感興趣嗎？

RPA是什么？

基本原理

重組酶聚合酶擴增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），被稱(chēng)為是可以替代PCR的核酸檢測技術(shù)。RPA技術(shù)主要依賴(lài)于三種酶：能結合單鏈核酸（寡核苷酸引物）的重組酶、單鏈DNA結合蛋白（SSB）和鏈置換DNA聚合酶。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，zui適反應溫度在37°C左右。

重組酶與引物結合形成的蛋白-DNA復合物，能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就會(huì )發(fā)生鏈交換反應形成并啟動(dòng)DNA合成，對模板上的目標區域進(jìn)行指數式擴增。被替換的DNA鏈與SSB結合，防止進(jìn)一步替換。在這個(gè)體系中，由兩個(gè)相對的引物起始一個(gè)合成事件。整個(gè)過(guò)程進(jìn)行得非?？?，一般可在十分鐘之內獲得可檢出水平的擴增產(chǎn)物。

圖片來(lái)源：Isothermal amplified detection of DNA and RNA

引物設計

RPA分析的關(guān)鍵在于擴增引物和探針的設計。PCR引物多半是不適用的，因為RPA引物比一般PCR引物長(cháng)，通常需要達到30-38個(gè)堿基。引物過(guò)短會(huì )降低重組率，影響擴增速度和檢測靈敏度。在設計RPA引物時(shí)，變性溫度不再是影響擴增引物的關(guān)鍵因素。RPA的引物和探針設計不像傳統PCR那樣成熟，用戶(hù)需要自己摸條件進(jìn)行優(yōu)化。

優(yōu)勢

常規PCR必須經(jīng)過(guò)變性、退火、延伸三個(gè)步驟，而PCR儀本質(zhì)上就是一個(gè)控制溫度升降的設備。RPA反應的zui適溫度在37℃-42℃之間，無(wú)需變性，在常溫下即可進(jìn)行。這無(wú)疑能大大加快PCR的速度。此外，由于不需要溫控設備，RPA可以真正實(shí)現便攜式的快速核酸檢測。

據介紹，RPA檢測的靈敏度很高，能夠將痕量的核酸（尤其是DNA）模板擴增到可以檢出的水平，從單個(gè)模板分子得到大約1012擴增產(chǎn)物。而且RPA還用不著(zhù)復雜的樣品處理，適用于無(wú)法提取核酸的實(shí)地檢測。

RPA既可以擴增DNA也可以擴增RNA，還省去了額外的cDNA合成步驟。你不僅可以對擴增產(chǎn)物進(jìn)行終點(diǎn)檢測，還可以對擴增過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監控，甚至可以通過(guò)試紙條（側流層析試紙條LFD）讀取結果。

RPA可以用來(lái)干什么？

RPA對硬件設備的要求很低，特別適合用于體外診斷、獸醫、食品安全、生物安全、農業(yè)等領(lǐng)域。以下為大家介紹RPA在細菌、病毒檢測以及癌癥研究等領(lǐng)域的應用情況。

RPA成為致病菌檢測的得力工具

在今年發(fā)表的一系列文章中，RPA技術(shù)被廣泛用于艱難梭狀芽孢桿菌、結核桿菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA、淋病奈瑟氏菌（Neisseria gonorrhoeae）、沙門(mén)氏菌、大腸埃希菌STEC等常見(jiàn)致病菌的檢測。在臨床診斷和食品安全方面，為人們提供了簡(jiǎn)單快速的實(shí)地篩查方案。（這篇文獻之前報道過(guò)，在這里就不詳述了。）[詳細]

RPA技術(shù)建立沙眼衣原體快速檢測方法

沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis）感染是zui常見(jiàn)的性傳播疾病之一。沙眼衣原體影響5-10%的人口，常見(jiàn)于小于25歲的成年人。目前廣泛使用的沙眼衣原體檢測方法是以聚合酶鏈反應（PCR）技術(shù)為基礎，這種方法只適合于經(jīng)過(guò)專(zhuān)業(yè)訓練的人員在具有特定儀器的實(shí)驗室使用。

日前，發(fā)表在《分子診斷雜志》（The Journal of Molecular Diagnostics）雜志上的一項研究中，研究人員利用RPA技術(shù)開(kāi)發(fā)了一種檢測沙眼衣原體的快速、靈敏的新方法，利用該方法在20分鐘內即可得出檢測結果。[參考文獻]

研究人員利用RPA技術(shù)直接從患者尿液樣本中檢測沙眼衣原體，不需要從尿液樣品提取總DNA，也不需要專(zhuān)門(mén)的儀器設備。而且該檢測方法還具有少費力、少耗時(shí)、更經(jīng)濟等特點(diǎn)。與目前的沙眼衣原體檢測方法比較而言，該方法還能夠顯著(zhù)提高檢測的敏感性和特異性

RPA檢測瘧原蟲(chóng)

澳大利亞科學(xué)家捕捉到瘧原蟲(chóng)入侵并摧毀人體紅細胞畫(huà)面

核酸擴增是目前zui靈敏的瘧原蟲(chóng)（P. falciparum）特異性檢測法。然而，PCR需要熱循環(huán)設備和專(zhuān)業(yè)性操作，資源匱乏的地區往往難以滿(mǎn)足這些條件。在這種情況下，與側流層析結合的RPA有著(zhù)很大的應用前景。

《Malaria Journal》雜志今年三月份發(fā)表的一項研究中，研究人員將RPA基礎反應、TwistAmp nfo探針和側流層析結合起來(lái)，實(shí)現了瘧原蟲(chóng)18S rRNA基因的高靈敏度快速檢測。在38°C的條件下，只需要不到十分鐘的擴增，就能檢出含有四個(gè)瘧原蟲(chóng)的樣本。加上側流層析的檢測時(shí)間，整個(gè)流程總共只需要15分鐘，而且肉眼可以直接看到檢測結果。

研究人員用不同瘧原蟲(chóng)測試了這種方法的靈敏度和特異性。研究顯示，所有瘧原蟲(chóng)都被成功檢出，所有非瘧原蟲(chóng)都得出了陰性結果。文章指出，這一方案將大大改善資源匱乏地區的瘧原蟲(chóng)分子診斷。[參考文獻]

RPA檢測冠狀病毒

2012年在中東鑒定的中東呼吸綜合癥冠狀病毒( Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)是一種新型的冠狀病毒。這種病毒很快傳入了歐洲，給公共安全機構敲響了警鐘。

目前，MERS-CoV檢測主要依賴(lài)于實(shí)時(shí)RT-PCR，需要收集患者樣本然后到專(zhuān)門(mén)的實(shí)驗室去檢驗。因此，亟需能夠進(jìn)行實(shí)地檢測的快速裝置。

《PLOS Currents：Outbreaks》去年十二月發(fā)表的一項研究，開(kāi)發(fā)了一個(gè)能在3-7分鐘內鑒定MERS-CoV的便攜式RT-RPA裝置。在42°C條件下，等溫MERS-CoV RT-RPA與實(shí)時(shí)RT-PCR一樣敏感，可檢出10個(gè)RNA分子。文章指出，這個(gè)便攜裝置是監控MERS-CoV傳播，尋找其動(dòng)物宿主的理想方法。[參考文獻]

RPA檢測埃博拉等十種致命威脅

檢測傳染性疾病的綜合panel，有助于資源匱乏地區進(jìn)行實(shí)地分子診斷，對生物防御工作也有很大的幫助。

《Journal of Clinical Microbiology》雜志去年四月的一項研究開(kāi)發(fā)了一個(gè)RPA檢測panel，對土拉弗朗西斯氏菌（Francisella tularensis）、鼠疫耶爾森氏菌（Yersinia pestis）、炭疽芽孢桿菌（Bacillus anthracis）、天花病毒進(jìn)行RPA分析，對裂谷熱病毒（Rift Valley fever virus）、埃博拉病毒、Sudan病毒和馬爾堡病毒進(jìn)行RT-RPA分析。研究顯示，這些RPA和RT-RPA的分析靈敏度大多在16-21個(gè)分子之間（與實(shí)時(shí)PCR相當），42°C下只需運行6-10分鐘，而且不存在交叉反應。[參考文獻]

RPA檢測HIV

在HIV診治中，即時(shí)檢測是非常重要的，對嬰兒來(lái)說(shuō)更是如此。有案例顯示，HIV感染后立刻進(jìn)行治療就能控制住患者體內的病毒，讓它們無(wú)法進(jìn)行復制。舉例來(lái)說(shuō)，生來(lái)就攜帶HIV的密西西比嬰兒，在出生后立即得到了治療。后來(lái)這個(gè)孩子停藥了兩年多，病毒復制依然得到了控制。

目前嬰兒HIV診斷的金標方法是DNA PCR，但許多地區并不具備這樣的條件。在這種條件下，RPA技術(shù)正好可以大展身手。（四篇論文介紹了RPA在HIV檢測中的應用）[詳細]

RPA在癌癥研究中的應用

去年六月，新加坡A*STAR的研究團隊在Lab on a Chip雜志上，發(fā)表了一種能夠快速檢測癌癥單點(diǎn)突變的新技術(shù)，等溫固相擴增/檢測（ISAD）。這是一種無(wú)需標記的實(shí)時(shí)檢測技術(shù)，將基于硅基微環(huán)（silicon microring）的固相擴增與等溫重組酶聚合酶擴增（RPA）結合在一起。

去年十月，Talanta雜志上也發(fā)表了一項用到RPA技術(shù)的癌癥研究。該研究在超靈敏生物條碼分析（BBC）、適配體（aptamer）和RPA的基礎上，開(kāi)發(fā)了一個(gè)檢測細胞色素C（Cyto-c）的新生物條碼分析法（ABC）。細胞色素C是細胞死亡的重要標志物。（點(diǎn)擊鏈接查看這兩項研究的詳細報道和文獻）[詳細]

RPA全攻略之疑難解答

說(shuō)了這么多，你們肯定會(huì )有很多疑問(wèn)，引物怎么設計？RPA反應能實(shí)現多重化么?RPA反應能對模板進(jìn)行定量么? RPA支持生物素或熒光標記的寡核苷酸么? RPA支持生物素或熒光標記的寡核苷酸么?以下就為大家一一解答。

RPA的擴增引物可以說(shuō)是整個(gè)反應的關(guān)鍵所在，那么怎樣才能設計好RPA引物呢？引物長(cháng)度怎樣選擇？引物序列有什么要求？擴增產(chǎn)物長(cháng)度有何限制？篩選的主要流程？答案詳見(jiàn)《RPA：引物與探針的常見(jiàn)問(wèn)題》一文。此外，在該文中你還可以找到以下問(wèn)題的答案。

可以。RPA在同一個(gè)管中同時(shí)進(jìn)行多個(gè)擴增反應。不過(guò)，多重化的引物組合需要精心設計，以便每個(gè)引物都能同樣有效的工作。需要注意的是，RPA反應的引物總量(nmol)不要超標太多。如果在一個(gè)反應中使用兩個(gè)以上的擴增引物，就應該控制不同引物的量。另外，我們應當事先考慮好檢測多個(gè)擴增事件的探針、設備以及熒光團的兼容性。

可以。擴增子達到可檢出水平的時(shí)間，依賴(lài)于反應起始時(shí)的模板量。初始模板的拷貝越多，擴增子就越快達到可檢出水平。不過(guò)，這種定量需要精心的實(shí)驗安排，確保對照反應是同時(shí)開(kāi)始的。舉例來(lái)說(shuō)，可以利用鎂離子的添加時(shí)間進(jìn)行控制。因為鎂離子一旦進(jìn)入體系，RPA反應就會(huì )開(kāi)始。

此外，較慢的擴增過(guò)程有助于更的定量。我們可以通過(guò)調整反應條件或引物設計來(lái)減慢RPA的反應速度。

可以。這樣比較的是反應開(kāi)始時(shí)的熒光和反應結束時(shí)的熒光，熒光增強意味著(zhù)發(fā)生了擴增。

支持。在RPA反應中，連有生物素或熒光團的引物與未修飾的引物表現差不多。據悉還沒(méi)有發(fā)現任何差異。

可以。插入性染料可以在RPA反應中進(jìn)行定量和監控。不過(guò)，這種染料可以結合任何雙鏈DNA，會(huì )生成來(lái)自引物的假陽(yáng)性信號。由于RPA擴增在常溫下進(jìn)行，這種噪音會(huì )比PCR嚴重一些。

需要。RPA反應中的物質(zhì)會(huì )干擾瓊脂糖電泳，如果不進(jìn)行產(chǎn)物回收，跑出來(lái)的帶會(huì )出現拖尾。

小編寄語(yǔ)

小編其實(shí)對PCR還是蠻有陰影的，之前很多做分子生物學(xué)的朋友經(jīng)常說(shuō)的一句就是：“怎么又沒(méi)P出來(lái)！"PCR好像“承包"了核酸檢測似的。雖然小編現在不用做實(shí)驗室了，但是還是希望新技術(shù)可以對在科研一線(xiàn)的你們有幫助。